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RNAi的研究历史和现状*

作者 :石 勇1 胡 征1 李华屏更新时间:2012-11-13

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摘 要 RNAi即RNA干涉,也就是在生物体中导入dsRNA引起体内同源基因特异性的沉默的想象,它是一种普遍存在于生物界的生命现象,也是现在生命科学领域的一个研究热点。从RNAi的研究历史、RNAi的分子机制、RNAi的遗传学途径、RNAi的应用与展望四个方面对RNAi的研究历史和现状进行了简要的综述。
关键词 RNAi dsRNA 研究现状
中图分类号 Q78 文献标识码 A

1 RNAi的研究历史
早在20世纪20年代人们就知道,如果植物事先受到野生病毒的感染,就能产生对另一种有亲缘关系的烈性病毒的抵御力,这可能是人们能够追溯到的最早的RNAi现象。
线虫(Caenorhabditiselegans)的第一次卵裂是不对称的,所形成子细胞的大小、胞浆成分以及将来的命运都不相同。1995年,GuoSu试图证明par1基因的失活会破坏线虫第一次卵裂的这种不对称性。她在关闭par1基因的表达时使用了反义技术,即注入反义RNA(antisence RNA),使它和par1基因的转录物杂交,从而阻断蛋白的翻译过程。但令人惊讶的是,在她的对照试验中,顺义RNA(sense RNA)也同样使par1基因的表达关闭了。直到1998年,Fire等人发现dsRNA能够比反义RNA或顺义RNA更有效地关闭基因的表达,他们称这种现象为RNA干涉(RNA interference, RNAi),并且认为顺义RNA引起基因抑制是因为其中混入了极少量的dsRNA。
在真菌中发现RNAi现象的是Cogni等人。1994年,他们在野生型粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)中转入胡萝卜素基因albino1或albino3时,发现在部分实验中,内源性al1或al3基因的表达水平反而大为减弱了。他们称这种现象为消除作用。
在以后的研究中人们在越来越多的生物中发现了RNAi现象。迄今已经在果蝇(Drosophila)、布氏锥虫(Trpanosomabrucei)、涡虫(Planaria)和水螅(Hydra)等无脊椎动物中发现有RNAi,尤为重要的是,在脊椎动物中,斑马鱼(Zebrafish)和小鼠早期胚胎也发现存在RNAi现象。随着研究的深入,不同研究领域的科学家逐渐认识到这些现象可能存在共同的分子机理。虽然遗传学和生物化学的方法都已用于探索RNAi的机制,但目前真正的机理尚未明了。
2 RNAi的分子机制
细胞内靶mRNA在dsRNA出现后,即发生降解,大致分为以下几个阶段进行:
(1)siRNA形成阶段:此阶段需要Rde-1(Rde指的是RNA indefecitive)和Dicer共同参与。C.elegans中,Rde-1(RNAi缺陷基因-1)是Rde基因家族成员之一,与脉孢菌(Neurospore)中的qde-2和拟南芥(Arabidopsis)中的ADO-1同源,在哺乳动物细胞中的Rde-1可能与翻译起始因子有关。Dicer是Ⅲ型RNA酶活性区域,dsRNA结合区域以及DEAH/DexH RNA解旋酶活性区。Rde-1编码的蛋白识别外源dsRNA,引导dsRNA与DCR-1编码的Dicer结合。dsRNA与Dicer结合后,Dicer先将dsRNA解旋,再将其裂解为21~23个核苷酸大小的片段。这些小片段RNA称为小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。经实验发现,Dicer定位于胞浆,提示RNAi发生于成熟的mRNA自核内移出后。另外研究发现,核内mRNA剪切修饰后在向核外运输过程中也存在RNAi现象,除了Dicer以外,可能还有其他类似功能的酶发挥作用。但RNA前体(hnRNA)则能抵抗RNAi效应。现认为21~23个核苷酸大小并在3’末端带有2~3个碱基(dTdT或UU)悬端的siRNA诱导的RNAi效应最强。因为21~23bp的RNA片段识别其同源互补序列的特异性最佳。过短,则会减弱siRNA的识别特异性;过长,则较易引起与靶序列的不完全匹配,扩大了siRNA攻击靶目标的范围。而3’悬末端则能增强基因沉默的效应。
(2)RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced siliencing complex,RISC)形成阶段:生成的siRNA与RNAi特异性酶(Ago-2等)结合,形成了RISC,具有序列特异性的核酸内切酶活性,能特异性地降解与siRNA同源的靶mRNA。虽然Ago-2与Dicer共有PAZ区,但实验证明Dicer过程与RISC过程之间是独立的,RISC并不能介导dsRNA生成siRNA,表明Dicer并不参与RISC形成过程。RISC中具体涉及到的催化亚基还有待进一步探究。
(3)效应阶段:RISC中siRNA变性,双链解开,卸下正义链,反义链仍结合在复合物上,并引导RISC与同源的靶目标RNA结合,在核酸内切酶的作用下,自siRNA中点位置处将靶mRNA切断,从而阻断了其翻译成蛋白质的活性。
SiRNA识别靶序列是具有高度特异性的。但并不是反义链上所有的碱基都对发挥这种特异性起到了相同的作用。由于降解过程首先发生在与siRNA相应的中央位置,这些碱基位点就显得格外重要,一旦发生错配,就会严重抑制RNAi效应。相对而言,3’末尾的核苷酸序列并不要求与靶mRNA完全匹配。此外,在引导RISC与靶mRNA结合时,3’末尾倒数第二个碱基起了较为重要的作用,因此该处也不能出现错配现象。
(4)扩增阶段:实验发现,新生成的siRNA的裂解是通过一种RNA聚合酶的链式反应。该反应以siRNA中的一条链为引物,以靶mRNA为模板,在RNA介导的RNA聚合酶(RdRP)的作用下,扩增靶mRNA,产生新的siRNA亚群(也称为二级siRNA),为单链的具有明显极性的反义RNA,而这些二级siRNA又能继续反作用于靶mRNA,令其降解。这是一个RNAi的循环扩增过程,解释了为什么在线虫中很小剂量的dsRNA就能诱发强烈的基因沉默效应。RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数,而且能将异常的单链RNA(ssRNA)转变成dsRNA。但在果蝇和哺乳动物细胞中却发现RdRP同源物缺失,提示要么存在另外的RNA聚合酶参与扩增反应,要么siRNA的阀值较低,初始浓度的siRNA足以引发强大的RNA干扰效应。
3 RNAi的遗传学途径
实验人员一般通过筛选RNAi抗性的突变个体来筛选参与RNAi过程的基因。以华丽新小杆线虫、脉孢菌、拟南芥为实验材料筛选得到的Rde-1(Rde指的是RNA indefecitive),Qde-2(Qde指的是quelling defective)和ago1,有很大的同源性。和Rde-1同源的其他基因还有植物基因pinhedd/zwille,argonqute,果蝇基因piwi,sting,人类基因hiwi的蛋白产物以及兔子的Eif2C同源。Zwille,argongaute,piwi和sting和干细胞的维持有关。EIF2C则是翻译起始因子。这个不断扩大的基因家族说明,RNAi可能和生物体内的其他途径密切相关。另外一组分别从脉孢菌、拟南芥和华丽新小杆线虫筛选得到的基因Qde-1,sgs2/sde1,以及ego-1,属于RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)家族。推测导入的dsRNA可能为RdRP提供了RNA复制的模板,合成更多的RNA,引起级联放大效应。线虫的RNAi的初期并不需要smg-2,smg-5,smg-6基因的参与。但RNAi效应的维持则需要。可能SMG蛋白是用来扩增RNAi的信号,以使RNAi得以在个体的整个生活周期维持。SMG-5和SMG-6使SMG-2脱磷酸基。SMG-2和酵母的UPF1同源,有RNA结合区,ATP酶活区和解螺旋酶活区。可能SMG-2是用来解开dsRNA双螺旋,使RdRP能合成dsRNA。在一些PTGS缺陷株和RNAi缺陷株里,受抑制的TE得到活化;相反,在RNAi和PTGS植株的提取物里也获得了含TE序列的长约21nt的dsRNA。由此看来,生物对TE的管制不仅通过DNA自身甲基化,还通过对TE的mRNA降解来实现。从TE活化的RNAi缺陷株得到已经鉴定和RNAi相关的基因有mut-1,mut-7。其他从基因沉默缺陷型突变的筛选得到的蛋白有DDM1(改变染色质的结构),MET1(一种甲基化酶),RDE2,RDE3和MUT2(可抑制TE的活性)。SGS3和RDE4功能未知。
4 RNAi技术的应用与展望
RNAi技术之所以可能成为一种十分有用的分子遗传学实验手段,一是由于随着基因组计划带来大量遗传信息资源,使得寻找新的基因、弄清基因的功能和基因间的相互关系等变得更为迫切;二是有目的地合成dsRNA,进行特异性基因阻抑的整个过程所需要的技术环节,对许多实验室来说并非难事。因此,从技术角度上也较容易普及;三是现在发展的新型RNAi技术,用转基因法导入构建好的质粒,此质粒里含有靶基因序列的反向重复,且质粒表达受高效的特异启动子(如热启动子等)的控制。这种方法构建的转基因动物或转基因植株,有3个优越性:①RNAi效应可遗传。因此可以培育大量的研究用实验动物或植株。②dsRNA的表达受特异启动子的控制,可以有目的地在一定的时相内启动RNAi。一些在动物发育过程中有关键作用的基因,如果在DNA水平采用基因敲除或突变进行可遗传的修饰,则会过早地基因沉默,产生致死表型,因而无法深入研究。但是如果能够在可控制的发育阶段启动RNAi,则规避了这一问题,方便了对发育早期的关键基因在发育后期的功能研究。在这一点上RNAi比基因敲除更具优越性。③用转基因法导入dsRNA产生的RNAi,可应用于神经系统,而用传统方法很难把dsRNA导入神经细胞中,也就很难产生RNAi效应。现在已有若干实验室运用了RNAi技术从事大规模的基因组筛选。他们主要是针对胚胎发育、细胞分裂、性腺发育这些生物学过程,筛选影响和参与其中的关键性基因。用RNAi技术进行功能基因组的筛选,其基本原理是根据基因组测序结果,针对每个基因设计对应序列的dsRNA,构建成基因组的dsRNA文库。将文库中不同序列的dsRNA分别导入不同个体的细胞内,从表型的改变上寻找相关基因并由此大致确定基因功能。这个技术使我们能够将序列和功能直接连接起来,开辟了功能基因组研究的新方法。但是,这个方法也存在局限性:dsRNA可导致基因组中有相同序列的不同基因同时发生沉默,对功能基因的分析造成干扰;不同的基因,以及同一基因外显子的不同区段对RNAi的敏感性可能有所不同。这可能是由于mRNA结合蛋白阻碍siRNA的降解作用或其他原因所致。
尽管对RNAi的机制研究仅仅两三年就已经取得许多重要的成果,但是仍有许多环节需要进一步地探查,以使这幅以“同源性依赖的两步降解机制”为主题的“拼图”更加完整。在这个机制中,dsRNA的引发作用,Dicer的RNaseⅢ样酶活性,siRNA的导向功能,siRNA对靶RNA的降解,它们彼此联系,大致描述了RNAi的生化途径。但是,RNAi准确的遗传学机制仍然不清楚。人们已经在各物种上发现许多和RNAi密切相关的基因,这些基因以何种方式组合在一起来控制RNAi过程,这些基因及其基因产物和RNAi的生化过程如何对应,这些基因在不同的生物中对RNAi的贡献有何不同,都是需要进一步研究的问题。RNAi涉及到对异常RNA的识别、信号的放大和细胞间传递、信号的维持等方面。有文献报道钙信号可调节植物的PTGS过程。这提示在基因沉默过程中,存在哪些分子间信号传递系统,以及这些系统之间…… 职称论文发表网http://www.issncn.com 职称论文发表网http://www.issncn.com

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